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连 云 港 师 范 高 等 专 科 学 校

毕 业 论 文（设 计）

论 文 题 目： 酸奶中乳酸菌菌落总数的测定

姓 名： 朱 九 凤

系 科： 生命科学系

专 业 、 班 级： 08生物技术及应用

指 导 教 师： 沈 洁

连云港师范高等专科学校教务处

中文摘要

摘要: 本试验采用平板记数法，对完达山优钙酸牛奶、伊利原味酸牛奶、君乐宝原味发酵型酸牛奶3个品牌市售酸奶中乳酸菌菌落总数进行了测定。测定结果显示，完达山优钙酸牛奶、伊利原味酸牛奶、君乐宝原味发酵型酸牛奶3种市售酸奶均符合国家标准(GB2746-1999)规定的质量标准。其中，完达山优钙酸牛奶中乳酸菌菌落总数最多，平均达到298cfu/mL，最少是君乐宝原味发酵型酸奶平均达到110 cfu/mL。

关键词: 酸奶；乳酸菌；菌落总数的测定；平板记数法

ABSTRACT

Abstract: This test method to count the flat panel, WanDaShan optimal calcium yogurt, YiLi flavor to the yogurt, JunLeBao plain yogurt fermentation type three the sold yogurt active lactobacillus total colonies were determined. The determination results showed that WanDaShan optimal calcium yogurt, Yili flavor to the yogurt, jun LeBao plain yogurt fermentation type three the sold yogurt which conform to the national standard (GB2746-1999) stipulated quality standards. Among them, WanDaShan optimal calcium in the most lactic acid bacteria colonies yogurt, average was exceed 298 cfu/mL, At least a royal LeBao plain yogurt fermentation type average was exceed 110 cfu/mL.

Keywords: yogurt, lactic acid bacteria, determination of total colonies, plate counting method

酸奶中乳酸菌菌落总数的测定

1.引言

随着人们经济水平的提高及自我保健意识的增强，乳制品日益受到广大消费者的喜爱。酸奶是以灭菌乳接种乳酸菌发酵而成，比普通牛乳的营养更丰富,其蛋白质和钙更易于被人体消化吸收。酸奶还有增强消化、促进肠蠕动、增进机体的物质代谢、产生有益抗生素、抗衰老、抗肿瘤等作用[3]，这是因为酸奶中含有大量的乳酸菌。乳酸菌都对人体有益，但乳酸菌需达到一定数量，才有可能到达并定植在人体肠道内，抑制有害菌的增殖和活动，维持肠道的微生态平衡，增进人体的健康。因此，乳酸菌数量是评价乳酸菌制品质量的重要指标。

乳酸菌多数属于厌氧菌或微好氧菌,在普通培养条件下，乳酸菌菌体生长十分缓慢，甚至不能生长,这给乳酸菌的研究带来了许多不便[6]。

本试验拟采用中华人民共和国国家标准(GB4789.2—2010)中[2]规定的食品中菌落总数测定方法---平板记数法，对完达山优钙酸牛奶、伊利原味酸牛奶、君乐宝原味发酵型酸牛奶3个品牌的袋装酸牛奶中乳酸菌菌落总数进行测定，以考查市场酸奶产品的质量。

2.材料与方法

2.1实验样品

本实验以市售完达山优钙酸牛奶、伊利原味酸牛奶、君乐宝原味发酵型酸牛奶3个品牌的袋装酸奶为实验材料。材料均选自于连云港市新浦区苍梧路乐天玛特大型超市。在产品保质期内完成测定，详情情况见表1。

表1 样品编号及量取体积

2.2主要的试剂与仪器

2.2.1试剂 生理盐水配制 称取9克氯化钠，用蒸馏水溶解定容至1000 ml，备用。

2.2.2主要设备与仪器 超净工作台（SW-CJ-1B）、手提式高压蒸气灭菌锅(上海三申医疗器械YX280A)、恒温培养箱(PYX-120)、显微镜(OLYMPUS CH20)等。

2.3培养基

在对完达山优钙酸牛奶、伊利原味酸牛奶、君乐宝原味发酵型酸牛奶3个品牌的袋装的酸牛奶进行的预实验中发现，乳酸菌不适合在普通牛肉膏蛋白胨培养基上生长；然后在老师的指导与建议下，同时根据学校实验室现有条件，最终确定本次实验采用LAB培养基（乳酸菌菌落计数用）。

2.3.1培养基的主要成份 LAB培养基的主要成份是，牛肉膏、酵母膏、乳糖、吐温80 、无水碳酸钙、无水磷酸二氢钾、琼脂、蒸馏水。

2.3.2培养基（1000ml）的配制及其灭菌 取一个白瓷缸洗干净后盛500毫升蒸馏水放于电炉上加热，水沸后加入已称量好的牛肉膏10g、酵母膏10g、乳糖20g、吐温80 1.0 ml、无水碳酸钙10g、无水磷酸二氢钾2g，用玻璃棒不停搅拌，再加入琼脂10 g，同时调低电炉温度，不停搅拌，待琼脂全部溶解均匀时调pH 值至6.6，定容至1000ml，关掉电源，分装培养基。高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间20分钟[1]，取出备用。

2.4准备工作

将洗干净的培养皿，移液管，试管放置至彻底干燥，取适宜尺寸的干净牛皮纸分别将培养皿、移液管、试管包扎紧[4]。然后高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间15分钟，取出备用。

3．实验过程

3.1编号

取无菌平皿3 套，用记号笔标明10-7两套，剩余一个标明CK,为空白对照。另取7支灭菌空试管，分别加入9ml灭菌生理盐水，排列于试管架上，用记号笔依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。

3.2 样品稀释

用1ml无菌吸管精确地吸取1ml完达山优钙酸牛奶样液加入10-1的试管中，然后仍用此吸管将管内稀释液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开液面，使其混合均匀。另取一支无菌吸管自10-1试管中吸1ml放入10-2中，吸吹三次，其余依次类推，如此稀释到第7管，稀释度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。伊利原味酸牛奶、君乐宝原味发酵型酸牛奶分别按照以上叙述进行稀释。通过预试验，本实验所采用的完达山优钙酸牛奶的稀释度为10-7，伊利原味酸牛奶的稀释度为10-7，君乐宝原味发酵型酸牛奶的稀释度为10-7。

3.3制作平板

取1ml灭菌吸管，吸取1ml空白稀释液生理盐水加入CK中，做空白对照。

用1支1ml无菌吸管吸取10-7的完达山优钙酸牛奶稀释菌液1ml，放入编好号的无菌平皿中，做两个平板，加上空白对照，共3个平板。分别在以上3个培养皿中注入15毫升已融化并冷却至45℃左右的LAB培养基，并且迅速轻轻地、小幅度地旋转几圈，使培养基均匀地平铺于培养皿底部，并且迅速在超净工作台面上作平面旋摇，使稀释液与培养基充分混合。伊利原味酸牛奶、君乐宝原味发酵型酸牛奶分别按照以上叙述进行平板制作。

3.4菌落培养

待培养基凝固后，移至37℃恒温培养箱中，倒置，培养48小时。

3.5菌落计数

计数时，采用肉眼观察，必要时用放大镜检查[5]，以防遗漏。先记下各培养皿内菌落数后，再求出每个样品同一稀释度的各平皿的平均菌落数。

4.结果

4.1菌落观察结果

菌落呈圆形，白色；大小不一，分布不均匀；

4.2菌落计数结果

用直接计数法，记录每个平板的菌落数，然后计算每个样液同一稀释度的两个平板的平均菌落数[7]。

样品的测定与出厂间隔天数为3天时，完达山优钙酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为297、299，伊利原味酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为251、265 ，君乐宝原味发酵型酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为174、180；样品的测定与出厂间隔天数为6天时，完达山优钙酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为271、277，伊利原味酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为196 、200，君乐宝原味发酵型酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为127、135；样品的测定与出厂间隔天数为9天时，完达山优钙酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为212、214，伊利原味酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为119、125，君乐宝原味发酵型酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为108、112。详细结果见表2。

表2 各样品的菌落计数的结果

4.3计算样液中的乳酸菌菌落数

同一稀释度做了两个平行样，稀释度均为10-7，按下列公式进行计算：

计算公式为：N=∑C/2×d

公式中：N——样品中菌落数

∑C——平板中菌落数之和

d——稀释度

4.3.1计算结果

样品的测定与出厂间隔天数为3天时，完达山优钙酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为297cfu/ml、299 cfu/ml，代入公式N=∑C/2×d=（297+299）/2×107=298×107 cfu/ml，伊利原味酸牛奶中乳酸菌菌落总数分别为251cfu/ml、265 cfu/ml，代入公式N=∑C/2×d=（251+265）/2×107=258×107 cfu/ml，君乐宝原味发酵型酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为174cfu/ml、180 cfu/ml，代入公式N=∑C/2×d=（174+180）/2×107=177×107 cfu/ml；样品的测定与出厂间隔天数为6天时，完达山优钙酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为271cfu/ml、277 cfu/ml，代入公式N=∑C/2×d=（271+277）/2×107=274×107 cfu/ml，伊利原味酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为196cfu/ml 、200cfu/ml，代入公式N=∑C/2×d=（196+200）/2×107=198×107 cfu/ml，君乐宝原味发酵型酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为127cfu/ml、135cfu/ml，代入公式N=∑C/2×d=（127+135）/2×107=131×107 cfu/ml；样品的测定与出厂间隔天数为9天时，完达山优钙酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为212cfu/ml、214cfu/ml，代入公式N=∑C/2×d=（212+214）/2×107=213×107 cfu/ml，伊利原味酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为119cfu/ml、125cfu/ml，代入公式N=∑C/2×d=（119+125）/2×107=122×107 cfu/ml，君乐宝原味发酵型酸牛奶中乳酸菌菌落数分别为108cfu/ml、112cfu/ml，代入公式N=∑C/2×d=（108+112）/2×107=110×107 cfu/ml。

5.分析与讨论

在对选用的完达山优钙酸牛奶、伊利原味酸牛奶、君乐宝原味发酵型酸牛奶3个品牌的袋装的酸牛奶进行的预实验中发现，样品稀释到10-5，10-6，菌落数太多，根本无法用肉眼计数。直至将样液稀释到10-7时，菌落生长数量才可以用肉眼计数，所以，本实验实验材料的稀释梯度为10-7。

倒平板时，应注意控制培养基的温度。温度过高会抑制菌的生长，而温度太低培养基易凝固，无法平铺均匀。所以本实验选择在培养基温度降至45℃时倒平板，效果良好。平板倒置培养48小时后，应立即计数。在有特殊原因不能立即计数时，我们将平板暂时放置于4℃冰箱保存，保存时间不超过24小时。

表3的实验结果表明，酸奶中所含的乳酸菌菌落数，随着出厂天数的延长呈明显下降的趋势，因此建议消费者购买时要看清生产日期，且还应尽早食用。表3的结果还表明，完达山优钙酸牛奶中所含的乳酸菌菌落数最多，达到298cfu/ml,其次是伊利原味酸牛奶，而含乳酸菌菌落数最少的是君乐宝原味发酵型酸牛奶，少至110 cfu/ml。造成这一差异的主要原因可能是，各品牌产品出厂时乳酸菌量的不同。

现在绝大部分儿童都特别喜爱喝乳酸系列饮料，然而乳酸对牙齿有一定的腐蚀作用[8]。所以，喝完酸奶后要及时漱口，或者最好使用吸管，可以减少乳酸接触牙齿的机会。另喝酸奶的最佳时间是饭后2小时左右。

参考文献

[1]GB16347-1996 中华人民共和国国家标准乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验[S].1996,145-152.

[2]中华人民共和国国家标准GB4789.2—2010食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定,2010,112-122.

[3]萨丽塔娜提·居努斯. 酸牛奶及乳酸菌饮料中乳酸菌的实验室测定. 新疆畜牧业[J], 2004,12(25):51-53.

[4] 朱宝玉,张秀丽,廖兴等.乳酸菌计数条件的优化研究[J].中国卫生检验杂志,2004,14(5):42-43.

[5] 方改霞,单林娜,李慧等. 多菌种酸奶中乳酸菌的计数方法研究.微生物学杂志[J],2009,05(24):55-56.

[6] 蔡东联,伍佩英,杨振南等. 味全乳酸菌饮料促进人体肠道健康功效的临床研究.中华疾病控制杂志[J],2010,06(14):32-35.

[7] 瞿明芳,张梦寒,邹文燕等. 酸奶中乳酸菌计数条件的研究,医学动物防制,2006,02(22):63-64.

[8]黄秀梨,辛明秀. 微生物学实验指导[M]. 高等教育出版社, 2008.

酸奶中乳酸菌菌落总数测定