感受态细胞的制备

一、 实验原理

受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。

本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。

二、 材料及准备工作

一）材料准备

二)试剂配制

1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）

2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）

温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。

3、TSS液（100ml）（有效期2周）

注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000

4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）

5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）

取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用

三）仪器设备

1、低温大容量离心机

2、恒温水浴锅

3、超净台

4、高压锅

5、37℃孵育箱

6、恒温摇床

7、制冰机

8、分光光度计

9、微量移液枪

10、低温冰箱

三、 步骤及注意事项

一）感受态制备（TSS法）

1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；

2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；

3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；

4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；

5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；

6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。

二）KCM法转化

1、冰上融化1管感受态细菌（也可室温化解后，再迅速冰浴）；

2、重取1个1.5ml离心管，加入20μl 5×KCM，DNA（建议不要超过10ng），水至100μl，放置冰中；

3、加入100μl 感受态细菌，混匀，继续冰中放置20-30mins；

4、42 ℃ 热休克 90s后，再插入冰中1-5min；（休克30s效果更好）

5、加入1 ml 37℃预热的LB（无氨苄），转移至摇菌管中，220rpm ，37℃ 孵育1h；

6、取100μl菌液，接种于含抗生素的LB平皿（也可以把菌液2000 rpm离心5 min，收集细菌，用预热LB重悬细菌，接种含抗生素的LB平皿上），37℃ 孵育过夜。

7、剩余的感受态，可做阴性对照。

三）注意事项

1、本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。

2、PEG 和MgCl2二者均可沉淀质粒DNA，且PEG 有使细胞壁具有穿透性, 允许DNA 进入细菌体内的生物学功能；这些可能是优于CaCl2 法的原因。

3、培养基PH值。pH值在6.8-7.2之间较好。保证菌摇好后，pH值不低于6.0。pH值在6.5以上，表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。

4、培养基离子浓度。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。使用20mmol/L MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。

5、培养温度。文献及经验证明，较低的温度培养有利于感受态的形成（一般18℃,一般的感受态，用室温即可），有利于获得较高转化效率的感受态。

6、感受态保存。文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要好,它会使感受态的效率增加。浓度不要超过7%。液氮速冻也会使感受态的效率提高，可用液氮速冻感受态12小时，然后保存于超低温冰箱内；也可在液氮中长时间保存而不降低效率。

7、热休克时间。有实验证明热休克时间30s能取得最好效果，而温度40-50℃均可，转化效率下降不明显。

8、转化质粒建议不要超过10ng，否则容易导致效率下降。

9、试剂使用国产分析纯即可，一定要过滤除菌，不能高压灭菌。

四、 结果判定

转化后的菌液，分3个梯度DNA量，转化三个LB平皿，计算平均转化效率。

转化效率1×106 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆、有限量的DNA的转化、T-克隆实验；大于1×10 8 cfu/μg DNA可用于构建文库和突变要求用的转化。

转化效率计算公式：

转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量（cfu/μg DNA）

这是最常用的方法，即计算每微克DNA经转化后可以得到的阳性克隆菌落的数目(clone formation unit, cfu)。但实际上，由于用于测定转染效率的质粒（一般要求超螺旋质粒）的分子量不同，每微克DNA所代表的DNA分子数也会有差异，因此一般情况上，转化效率测定使用的都是pBR322或pUC19等小分子量的质粒。

使用一个具体的例子来说明转化效率的计算方法：假设取0.1ng pUC19质粒转入100μl待测的感受态细菌中，按常规转化步骤进行冰浴和热击，加入900μl SOC培养基继续培养（此时DNA浓度为0.1ng DNA/ml，这里也可使用LB培养基，但最后得到的克隆菌的数目可能会降低）。然后再用SOC培养基进行1:10稀释（此时DNA浓度变为0.01ng DNA/ml），分别取100μl（含总量为0.001ng的DNA）涂布至两个平行的平板中。如果最后产生的菌落数为200 个（两个平板菌落的平均数），则转化效率为：

200 cfu/0.001ng = 2×108 cfu/μg（注:2×108 cfu/μg的转化效率，大约相当于可以将千分之一的pUC19质粒分子成功转入感受态细菌中。）

感受态细胞的制备及转化